當(dāng)電泳開始后，在這個pH條件下緩沖液中的HCl的Cl-幾乎全部解離，Gly解離出少量的甘氨酸根離子（Gly等電點為6.0，因此僅有少數(shù)解離為負(fù)離子）。由于蛋白質(zhì)分子在前處理后帶負(fù)電荷，因此在電場中和Cl-及甘氨酸根離子一起向正極移動。在電場移動過程中，Cl-移動最快，蛋白質(zhì)分子居中，甘氨酸根離子移動最慢，三類離子的遷移速率為Cl->蛋白質(zhì)分子>甘氨酸離子。電泳開始后，Cl-泳動快，在其后留下一個低離子濃度區(qū)。甘氨酸離子在電場中移動最慢，造成移動離子的缺乏，于是Cl-和甘氨酸根離子之間就形成了一個缺少離子的高壓區(qū)，具有較高的電場強度。在這高壓區(qū)內(nèi)所有的負(fù)離子都會加速移動，當(dāng)移到Cl-區(qū)域時，高電壓消失，蛋白質(zhì)的移動速度慢下來，當(dāng)以上穩(wěn)定狀態(tài)建立后，蛋白質(zhì)樣品在快慢離子間被濃縮形成一個狹小的之間層，按照電荷大小排列。但是由于目標(biāo)蛋白都帶有負(fù)電荷，所以位于同一的起點，這樣就起到了濃縮的作用。

從上層的濃縮膠進(jìn)入下層的分離膠后，膠的pH變高，Cl-電離從而達(dá)到正極，甘氨酸根離子的電離度增大，泳動率上升，很快就會跑超所有蛋白質(zhì)分子，緊跟在Cl-后達(dá)到正極，此時低離子濃度不再存在，分離膠中形成了一個恒定的電場強度。而這時還有蛋白質(zhì)分子在分離膠中進(jìn)行著緩慢的移動。根據(jù)蛋白質(zhì)分子受到溶液離子的影響導(dǎo)致pH發(fā)生變化，但因為所帶電荷數(shù)的單位質(zhì)量不同，所以帶負(fù)電荷多的移動快，反之則慢，這就有了電荷效應(yīng)。由于分離膠的孔徑大小差異，從而形成了一個整體的篩網(wǎng)結(jié)構(gòu)，對不同分子大小的蛋白質(zhì)來說，通過移動時受到的滯阻作用不同，即使靜電荷相等的顆粒，最終也會由于這種分子篩的效應(yīng)，把不同大小的蛋白質(zhì)相互分開。這樣就起到了分子篩作用。

一、蛋白樣品的制備

1、試劑準(zhǔn)備

5×loading buffer（以100mL為例）

配置方法：先SDS在1M Tris·Hcl中溶解，等待SDS溶解后加入其余物質(zhì)。

2、實驗步驟

將待測蛋白樣品與5×loading buffer按照4：1的比例混合，100℃煮沸10min。

3、原理

蛋白樣品制備的核心目標(biāo)是：將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物變性、還原和溶解，使其成為均一的、帶強負(fù)電荷的線性分子，從而確保其在后續(xù)電泳中的遷移率僅與分子量相關(guān)。這個過程主要依賴于上樣緩沖液的作用，其各個成分分工明確：

a.SDS - “破壞者"與“充電器"

1）破壞結(jié)構(gòu)：作為強陰離子去垢劑，SDS能破壞蛋白質(zhì)分子的氫鍵和疏水相互作用，摧毀其二級和三級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)去折疊。

2）均勻電荷：SDS會與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結(jié)合，大約每克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS。形成的“蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物"攜帶了大量的負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)自身所帶的電荷差異。這使得所有蛋白質(zhì)的“電荷-質(zhì)量比"近乎相同。

b.還原劑 - “剪刀手"

切斷二硫鍵：常用的還原劑如β-巰基乙醇 或二硫蘇糖醇，能夠斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的二硫鍵，將蛋白質(zhì)亞基分離開來，破壞其三級或四級結(jié)構(gòu)。

c.加熱 - “加速器"

促進(jìn)反應(yīng)：100℃煮沸5-10分鐘 為SDS和還原劑的作用提供能量，極大地加速蛋白質(zhì)的變性和還原過程，確保所有蛋白質(zhì)分子快速地線性化。

d.上樣緩沖液中的其他輔助成分

1）甘油：增加樣品密度，使樣品在點樣時能沉入加樣孔底部，防止飄散。

2)溴酚藍(lán)：一種小分子染料，作為電泳前沿的指示劑，讓我們可以直觀地觀察電泳進(jìn)程。

3)Tris-HCl緩沖液：提供穩(wěn)定的pH環(huán)境（通常為pH 6.8），確保反應(yīng)在最佳條件下進(jìn)行。

4、關(guān)鍵注意事項

1）樣品與上樣緩沖液的比例

黃金比例：通常使用 4:1 的比例混合樣品和 5×Loading Buffer。務(wù)必計算準(zhǔn)確并充分混勻，確保最終濃度為 1×。濃度過高會導(dǎo)致條帶扭曲，過低則蛋白可能變性不完整。 

2）防止蒸發(fā)：如果使用PCR管或離心管，建議在加熱前短暫離心，將液體收集到管底，并蓋上管蓋，以防止樣品蒸發(fā)濃縮，甚至燒干。

3）冷卻后離心：煮沸后，務(wù)必在點樣前進(jìn)行短暫離心（例如，10,000-12,000 rpm，1分鐘），將管壁和蓋上的冷凝水珠離下，并收集所有樣品，確保點樣量的準(zhǔn)確性。

 4）還原劑的穩(wěn)定性

β-巰基乙醇易氧化：它很容易被空氣氧化而失效。務(wù)必密封保存，并定期更換新試劑。如果發(fā)現(xiàn)實驗效果變差，這是首要排查對象。

5）樣品的處理與保存

避免反復(fù)凍融：制備好的蛋白樣品應(yīng)在 -20℃ 或 -80℃ 長期保存。為避免蛋白降解，建議分裝成小份凍存，每個小份只使用一次。

6）使用前處理：從冰箱取出的凍存樣品，應(yīng)在室溫或37℃水浴中溶解并混勻，然后短暫離心后再點樣。直接點樣凍存樣品可能導(dǎo)致濃度不準(zhǔn)和條帶不均一。

二、濃縮膠與分離膠的制備

1、試劑準(zhǔn)備

①30%丙烯酰胺溶液

②10%SDS溶液

③10%過硫酸銨溶液

④1.0M Tris（pH6.8）

⑤1.5M Tris（pH8.8）

2、濃縮膠與分離膠的配置

3、實驗步驟

（1）檢漏：取兩個干凈的玻璃板（一個短板-帶凹槽，一個長板），將兩塊板對齊，放在制膠架上，并固定卡緊，兩側(cè)一致，然后在兩側(cè)玻璃板間加水后靜置10min，查看是否漏夜。如果不漏液，把水倒掉，如果漏液，重新組裝，繼續(xù)檢漏。

（2）制膠：根據(jù)蛋白分子量選擇合適的分離膠，按照配方進(jìn)行配膠，除TEMED外的所有成分加入后，混勻，在灌膠前再加入TEMED。

（3）灌膠：將配制的下層膠灌入兩塊玻璃板之間，高度可以用梳子定位，大概是梳子下面1cm即可。輕輕晃動，使頁面水平，用水封膠，待下層膠凝固后把水倒掉，繼續(xù)配制上層膠，同樣，混勻，灌膠，插梳子，注意避免氣泡的產(chǎn)生，待膠凝固后，拔出梳子，放置待用。

4、原理：為什么不連續(xù)系統(tǒng)如此高效？

不連續(xù)系統(tǒng)之所以比單一膠（連續(xù)系統(tǒng)）高效，在于它通過兩層不同pH值和孔徑的凝膠，巧妙地實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)的 “先濃縮，后分離"。 

1）分離膠 - “分子篩"

作用：基于分子量大小分離蛋白質(zhì)。

原理：pH環(huán)境：高pH（~8.8）的Tris-HCl緩沖液。

凝膠濃度：較高（通常6%-15%），孔徑小，形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

工作機制：當(dāng)線性化的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)入分離膠時，小分子蛋白質(zhì)更容易通過凝膠網(wǎng)絡(luò)，跑得快；大分子蛋白質(zhì)受到更大的阻力，跑得慢。這種“分子篩效應(yīng)"使得蛋白質(zhì)按其分子量大小被分離開。

2）濃縮膠 - “壓縮器"

作用：在進(jìn)入分離膠之前，將稀薄的蛋白質(zhì)樣品壓縮成一條極窄的起始區(qū)帶。

原理：這是整個設(shè)計的精華，依賴于三種不連續(xù)性：

a.凝膠孔徑不連續(xù)性：濃縮膠濃度低（通常5%），孔徑大，對蛋白質(zhì)幾乎沒有阻力。這為蛋白質(zhì)的快速堆積提供了物理空間。

b.pH不連續(xù)性：濃縮膠的pH為~6.8。

c.離子不連續(xù)性：系統(tǒng)中的三種離子是關(guān)鍵：

•          Cl? （來自凝膠中的Tris-HCl）：遷移速率最快，稱為 “前導(dǎo)離子"。

•          甘氨酸根離子 （來自電泳緩沖液）：在濃縮膠的pH 6.8環(huán)境下，甘氨酸（pI~6.0）僅有少量電離，遷移速率最慢，稱為 “尾隨離子"。

•          蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物：攜帶大量負(fù)電荷，遷移速率介于兩者之間。

濃縮過程的動態(tài)演繹：

通電后，快離子（Cl?）迅速向前移動，離開了它原本所在的區(qū)域。

慢離子（甘氨酸根）在后面緩慢移動，導(dǎo)致快慢離子之間形成了一個 低離子強度、高電場強度的區(qū)域。

在這個高電場區(qū)域中，所有帶負(fù)電的顆粒（包括蛋白質(zhì)）都會被迫加速移動。

然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)加速追上快離子（Cl?）區(qū)域時，那里的電場強度恢復(fù)正常，蛋白質(zhì)速度立刻慢下來。

結(jié)果就是，所有的蛋白質(zhì)分子被“夾在"快慢離子之間，不斷地被壓縮、堆積，直到它們進(jìn)入分離膠界面，形成一個極其狹窄的區(qū)帶。

3）界面效應(yīng) - “角色轉(zhuǎn)換"

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和甘氨酸根離子到達(dá)濃縮膠與分離膠的界面時，環(huán)境pH突然從6.8變?yōu)?/span>8.8。甘氨酸在此pH下大量電離，遷移率急劇增加，迅速跑超所有蛋白質(zhì)，緊跟著Cl?向前移動。

后果：高電場區(qū)域消失，所有的蛋白質(zhì)分子在分離膠的同一“起跑線"上，開始純粹基于分子量進(jìn)行分離。

5、關(guān)鍵注意事項

制備凝膠是SDS-PAGE中最需要技巧和耐心的環(huán)節(jié)，任何疏忽都可能導(dǎo)致實驗失敗。

1）凝膠濃度的選擇

根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇：低濃度膠（如8%）利于分離大分子蛋白，但小分子蛋白可能會跑出膠；高濃度膠（如15%）利于分離小分子蛋白，但大分子蛋白可能無法進(jìn)入分離膠。

不確定時：使用 10%或12% 的分離膠是一個普適性較好的選擇。

2）配膠操作

a.TEMED 對空氣敏感，應(yīng)密封保存。

b.過硫酸銨溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，或小分裝于-20℃保存，因為它在水溶液中會迅速降解失效。

c.加入順序：應(yīng)最后加入這兩者，一旦加入，需快速混勻并立即灌膠，否則會開始在管內(nèi)聚合。

d.混勻：輕柔但地混勻，避免引入過多氣泡。

e.水封：灌完分離膠后，必須立即用無水乙醇或異丙醇封頂。這可以隔絕空氣（氧氣會抑制聚合），并壓平膠面。傾斜制膠架使其成斜面，緩慢加入，可以形成更平整的界面。

3）聚合控制

聚合時間：分離膠通常在15-30分鐘內(nèi)聚合。如果聚合過快（<5分鐘），可能是TEMED/AP過量，會導(dǎo)致凝膠過硬、易碎；如果聚合過慢（>30分鐘），可能是TEMED/AP失效或量不足，或室溫過低。

聚合判斷：在醇封層和凝膠之間會出現(xiàn)一條清晰的折射線，這表明凝膠已聚合。

4）濃縮膠制備

倒掉封層液：在灌濃縮膠前，必須倒掉分離膠上的醇封層，并用濾紙吸干殘留液體，否則會影響濃縮膠的聚合和界面形狀。

插梳子：

梳子需保持 絕對水平，否則加樣孔深度不一。

緩慢傾斜插入，以最大限度避免氣泡。如果產(chǎn)生氣泡，可輕輕拔起梳子，重新插入，或用電泳液沖洗孔道將其趕出。

拔梳子：聚合完成后， 輕柔地、垂直向上 拔出梳子。拔得太快或太歪可能撕裂加樣孔底部，導(dǎo)致點樣時漏液。

5）檢漏

這是絕對不能省略的步驟！組裝好玻璃板后，加水檢漏10分鐘，確保制膠架和玻璃板密封良好。否則灌膠后會發(fā)生泄漏，浪費試劑和時間。

6）安全須知

丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性物質(zhì)，可通過皮膚吸收。配制母液和操作時務(wù)必佩戴手套，并在通風(fēng)櫥內(nèi)稱量粉末。

三、凝膠電泳

1、試劑準(zhǔn)備

10×running buffer

使用方法：使用時，取100mL 10×running buffer，加水定容至1000mL，即1×running buffer。

2、實驗步驟：

（1）點樣：在電泳槽中加入電泳液，沒過凝膠，用移液器將蛋白樣品和Marker依次加入凝膠孔中，樣品每孔可加入20-30μL（總蛋白量20-100μg），Marker可加入5μL預(yù)染Marker，記錄順序。

（2）電泳：蓋上上蓋和導(dǎo)線，設(shè)定電壓電流開始電泳，待溴酚藍(lán)到達(dá)電泳槽底部，停止電泳，約1h。一般濃縮膠電壓為80V，等待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，調(diào)整電壓至120V，直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。注意正負(fù)極連接正確。

3、原理

1）電場驅(qū)動與電荷效應(yīng)

a.動力來源：在電泳槽兩側(cè)施加直流電壓，形成一個恒定的電場。

b.遷移方向：由于蛋白質(zhì)在SDS處理后攜帶大量負(fù)電荷，它們會從負(fù)極（陰極，通常為黑色插頭）向正極（陽極，通常為紅色插頭）遷移。

c.統(tǒng)一驅(qū)動力：所有蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物具有大致相同的“電荷-質(zhì)量比"，因此它們在電場中受到的初始驅(qū)動力是相同的。

2）指示劑 - 溴酚藍(lán)

溴酚藍(lán)是一個小分子染料，它也結(jié)合SDS帶上負(fù)電。

它在凝膠中的遷移速率比絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都快，因此可以作為 “電泳前沿"。

當(dāng)溴酚藍(lán)遷移到凝膠底部時，表明電泳即將結(jié)束，此時大部分蛋白質(zhì)（分子量通常>10 kDa）已在凝膠中得到了充分分離。

4、關(guān)鍵注意事項

1）電泳緩沖液

a.正確稀釋：必須使用 1× 的工作濃度。10×儲存液需準(zhǔn)確稀釋，濃度過高會導(dǎo)致產(chǎn)熱過多，過低則導(dǎo)電性差、遷移慢且條帶擴散。

b.重復(fù)使用：電泳緩沖液可以重復(fù)使用2-3次，但次數(shù)過多會導(dǎo)致離子強度下降、pH變化，影響結(jié)果穩(wěn)定性。如果發(fā)現(xiàn)條帶異?；螂娪緯r間顯著延長，應(yīng)更換新緩沖液。

2）點樣

a.記錄順序：點樣前務(wù)必在實驗記錄本上畫好點樣順序圖，并在凝膠上做好標(biāo)記（如切掉一角），防止混淆。

b.輕柔準(zhǔn)確：將槍頭伸入加樣孔底部，緩慢、平穩(wěn)地將樣品推出。動作太快或太深會刺破膠孔底部，或?qū)悠窙_入相鄰孔道，導(dǎo)致交叉污染。

c.空白孔處理：如果有未使用的加樣孔，應(yīng)加入等體積的 1×Loading Buffer 以防止鄰近條帶擴散。

3）電泳參數(shù)設(shè)置

a.電壓選擇：一般采用恒壓模式。

b.濃縮膠階段（80V）：低電壓可以使蛋白質(zhì)在濃縮膠中緩慢、充分地堆積，形成銳利的條帶。電壓過高會導(dǎo)致堆疊不充分，條帶變寬。

c.分離膠階段（120V-150V）：進(jìn)入分離膠后，可提高電壓以縮短時間。但電壓并非越高越好，過高的電壓會導(dǎo)致：

d.產(chǎn)熱過多：玻璃板燙手，熱量會使蛋白質(zhì)變性、條帶出現(xiàn)“微笑"效應(yīng)（中間快兩邊慢）。

e.條帶擴散：遷移過快，分子篩效應(yīng)不充分，分離效果差。

f.冷卻：如果實驗室條件允許，在電泳槽周圍放置冰盒或使用冷卻循環(huán)水裝置，可以有效地散熱，允許使用稍高的電壓同時獲得更好的結(jié)果。

4）電泳進(jìn)程監(jiān)控

a.觀察染料：密切關(guān)注溴酚藍(lán)的位置。當(dāng)其跑至凝膠底部約0.5-1cm時，即可停止電泳。

b.防止跑過頭：如果小分子蛋白是目標(biāo)，需在溴酚藍(lán)流出凝膠前停止，否則目標(biāo)蛋白可能已丟失。

c.觀察Marker：如果使用預(yù)染Marker，可以直觀地看到不同分子量蛋白的分離情況，便于控制電泳時間。

5）安全操作

a.連接電極：務(wù)必確保紅對紅，黑對黑（正極對正極，負(fù)極對負(fù)極）。接反會導(dǎo)致樣品向反方向跑出凝膠，實驗失敗。

b.防止觸電：在連接或拆卸導(dǎo)線、打開電泳槽蓋前，務(wù)必關(guān)閉電源。電泳液是導(dǎo)電的，操作不慎有觸電風(fēng)險。

c.檢查漏液：組裝電泳槽后，確保內(nèi)槽和外槽都加入了足夠的緩沖液，并且沒有漏液現(xiàn)象。

四、染色與脫色

1、試劑準(zhǔn)備

①染色液

②脫色液

2、實驗步驟

（1）染色：將制膠板取下，割去濃縮膠，將分離膠輕輕放入染色槽中染色，染色大概20-30min。

（2）脫色：染色完成后，回收染色液，用純凈水沖洗凝膠2-3次，然后放入脫色槽中，加入脫色液進(jìn)行脫色，直到?jīng)]有背景色為止。

這個過程的核心是讓蛋白質(zhì)條帶顯色，并通過去除背景色來增強對比度。傳統(tǒng)的方法是考馬斯亮藍(lán)染色法。

3、原理

1）染色原理 - “特異性結(jié)合"

a.染料：考馬斯亮藍(lán) G-250 或 R-250 是常用的染料。它們是一種有機化合物，本身在酸性條件下呈棕紅色。

b.結(jié)合機制：

范德華力與疏水作用：在酸性甲醇/乙酸環(huán)境中，考馬斯亮藍(lán)染料上的疏水部分會與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)相結(jié)合。

靜電引力：染料分子上的磺酸基團(tuán)帶負(fù)電，會與蛋白質(zhì)氨基酸殘基（如精氨酸、賴氨酸、組氨酸等）上帶正電的基團(tuán)發(fā)生靜電吸引。

c.顏色轉(zhuǎn)變：當(dāng)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其最大吸收峰會發(fā)生位移，從棕紅色變?yōu)樗{(lán)色。這種結(jié)合是化學(xué)計量的，即在一定的濃度范圍內(nèi)，結(jié)合的染料量與蛋白質(zhì)的量成正比，這就是半定量分析的基礎(chǔ)。

d.簡單來說，染色就是將藍(lán)色的染料“刷"在凝膠上，染料會特異性地“粘"在蛋白質(zhì)條帶上，而不會“粘"在空的凝膠上。

2）脫色原理 - “解離與擴散"

a.目的：去除背景中非特異性吸附在凝膠空白處的染料，使藍(lán)色的蛋白質(zhì)條帶在透明的背景下清晰地顯現(xiàn)出來。

b.甲醇：作為固定劑，能防止蛋白質(zhì)在脫色過程中從凝膠中擴散出去，同時也能幫助溶解和洗脫未結(jié)合的染料。

c.冰醋酸：提供酸性環(huán)境，維持染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性（確保條帶不褪色），同時也能幫助溶解和洗脫游離染料。

d.水：作為溶劑，通過濃度差促進(jìn)染料從凝膠內(nèi)部向外部溶液擴散。